線粒體活性氧產(chǎn)生速率（ROS）試劑盒熒光法說明書

熒光法 100管/96樣   

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

商品屬性：

產(chǎn)品

發(fā)貨地：上海

測(cè)定意義:

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，研究表明，機(jī)體95％以上的活性氧（ROS）都來自于線粒體，其失衡所致的氧化應(yīng)激與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程有關(guān)。
正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平維持在較低的生理范圍；在病理情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過多，就可破壞線粒體酶類、脂類和核酸，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，同時(shí)，活性氧還可攻擊線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能變化。
因此，通過檢測(cè)活性氧的變化來判斷線粒體的功能是否正常具有重要意義。

測(cè)定原理:

熒光探針-還原型二氯熒光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可擴(kuò)散通過線粒體膜，在線粒體內(nèi)被酯酶水解，形成無(wú)熒光的DCFH，DCFH迅速與ROS反應(yīng)生成熒光物—氧化型二氯熒光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根據(jù)上述原理設(shè)計(jì)了利用熒光法直接定量檢測(cè)線粒體ROS產(chǎn)生速率的方法。將熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合，線性回歸直線斜率與ROS產(chǎn)生的速率呈正比。
需自備的儀器和用品：
多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制:

試劑一：液體 120 mL×1 瓶, 4℃保存；

試劑二：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 1.5 mL×1 瓶,-20℃保存；

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 6 mL 試劑二充分溶解；

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 6 mL 試劑二充分溶解；

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 6 mL 試劑二充分溶解；

試劑七：液體×1 瓶, 避光-20℃保存；臨用前用試劑二稀釋 300 倍后使用；

線粒體提?。?/span>

1、準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將上述勻漿液于 600g（離心率），4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、棄上清，沉淀中加入 200μL 試劑二重懸

生化檢測(cè)試劑盒操作步驟：

一、?準(zhǔn)備工具和環(huán)境?：確保操作臺(tái)面干凈、整潔，這是進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)的步。杭州

?二、?仔細(xì)閱讀說明書?：這是使用試劑盒的基礎(chǔ)，說明書包含了所有必要的信息和操作指南。

三、樣本采集?：按照說明書的指導(dǎo)，正確采集樣本。不同類型的檢測(cè)可能需要不同類型的樣本，如血液、唾液或鼻涕等。

?四、樣本混合?：將樣本與試劑小心混合，注意輕柔操作，避免產(chǎn)生泡沫，以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

?五、?等待反應(yīng)?：混合后，耐心等待試劑盒的反應(yīng)，這個(gè)時(shí)間可以用來進(jìn)行其他活動(dòng)，但不要著急，因?yàn)楹玫慕Y(jié)果值得等待。

六、結(jié)果判讀?：時(shí)間到后，仔細(xì)判讀結(jié)果。試劑盒通常會(huì)有明確的指示，告訴你如何根據(jù)顯示的線條或顏色來判斷結(jié)果。

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注意事項(xiàng):

①加入試劑的順序應(yīng)一致,以所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。

②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。

③按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

④底物A應(yīng)揮發(fā),避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感,避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

⑤洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時(shí),避免使用帶金屬部分的加樣器 。

⑦實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。

⑧試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。

⑨不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。